糖尿病傷口愈合障礙新機(jī)制：中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)成纖維細(xì)胞鐵死亡

   糖尿病患者傷口延遲愈合顯著增加截肢和全身感染的風(fēng)險(xiǎn)。然而，其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。成纖維細(xì)胞通過分泌膠原蛋白參與創(chuàng)面修復(fù)，其功能障礙會(huì)嚴(yán)重影響創(chuàng)面愈合和組織再生。越來越多的證據(jù)表明，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）的過度產(chǎn)生會(huì)加劇局部炎癥并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而延遲傷口愈合。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，NETs導(dǎo)致傷口愈合障礙的確切機(jī)制仍不清楚。本研究利用體外和體內(nèi)模型來研究NETs通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)成纖維細(xì)胞鐵死亡并促進(jìn)受損糖尿病傷口愈合的分子機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明，NETs誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的鐵死亡，從而損害其膠原分泌能力。我們進(jìn)一步證明了IRE1α/XBP1，一個(gè)關(guān)鍵的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，參與了NETs誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞鐵死亡。此外，靶向該通路可顯著促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。這些發(fā)現(xiàn)為治療難治性糖尿病創(chuàng)面提供了新的分子靶點(diǎn)和潛在的治療策略。該研究于2025年5月發(fā)表在《Free Radical Biology and Medicine》，IF：8.2。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果：

1.糖尿病小鼠外周血和創(chuàng)面組織中NETs積累升高

   為研究NETs在糖尿病創(chuàng)面愈合中的作用，我們建立了糖尿病小鼠模型，并評(píng)估了NETs生物標(biāo)志物CitH3和MPO在創(chuàng)面組織和外周血中的表達(dá)水平。代表性免疫熒光圖像顯示，與對(duì)照組小鼠相比，糖尿病小鼠創(chuàng)面皮膚中CitH3和MPO的浸潤(rùn)顯著增加（圖1A）。對(duì)外周血中NETs水平的分析表明，糖尿病小鼠中的CitH3和MPO水平顯著高于健康對(duì)照小鼠（圖1B和C）。這些結(jié)果表明，在糖尿病條件下，外周血和創(chuàng)面組織中存在廣泛的NETs蓄積，表明NETs在糖尿病慢性創(chuàng)面的發(fā)病機(jī)制中是必不可少的。

圖1.糖尿病小鼠傷口組織和外周血中NETs積累升高

2.NETs以劑量依賴的方式誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）中的鐵死亡

   在本文中，我們使用中性粒細(xì)胞分離試劑盒從健康志愿者的外周血中分離中性粒細(xì)胞，并將其與100 nM PMA孵育4 h以誘導(dǎo)NETs形成（圖2A）。隨后使用免疫熒光觀察NETs的形成（圖2B）。我們利用微陣列基因表達(dá)譜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，以檢測(cè)NETs對(duì)成纖維細(xì)胞功能的影響及其潛在的調(diào)控機(jī)制。火山圖顯示，與對(duì)照組相比，NETs處理組有657個(gè)上調(diào)和371個(gè)下調(diào)的DEGs（圖2C）。熱圖分析顯示，PTGS2是NETs處理后上調(diào)最顯著的基因之一，表明其在鐵死亡調(diào)節(jié)中的潛在作用（圖2D）。為驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)，我們?cè)u(píng)估了用逐漸增加濃度的NETs（0、25、50和100 μg/mL）處理24 h的HSF細(xì)胞中PTGS2和SLC7A11（鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）的mRNA水平。此外，qPCR顯示PTGS2 mRNA水平呈劑量依賴性上調(diào)（圖2E），而SLC7A11 mRNA表達(dá)隨NETs濃度的增加而顯著下調(diào)（圖2F）。NETs處理以濃度依賴性方式顯著降低HSF活力（圖2G）。NETs暴露后LPO水平顯著升高（圖2H），而GSH水平以劑量依賴性方式降低（圖2I）。透射電鏡顯示經(jīng)nets處理的HSF中存在嚴(yán)重的線粒體損傷，包括線粒體萎縮、嵴斷裂和膜完整性受損（圖2J）。WB分析證實(shí)，NETs處理后PTGS2表達(dá)顯著上調(diào)，而SLC7A11水平降低（圖2K-M）。此外，關(guān)鍵ECM蛋白，COL I和COL III，以劑量依賴性方式顯著下調(diào)（圖2N-P）。這些結(jié)果表明，NETs以劑量依賴性方式誘導(dǎo)HSF發(fā)生鐵死亡，損害其膠原分泌能力。

圖2.NETs可誘導(dǎo)HSF發(fā)生鐵死亡

3. NETs通過誘導(dǎo)鐵死亡損害HSF活力和膠原分泌

   為探討鐵死亡在NETs誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙中的作用，我們研究了鐵死亡抑制劑ferrostatin-1 （Fer-1）對(duì)NETs誘導(dǎo)的HSF細(xì)胞功能障礙的影響。我們發(fā)現(xiàn)，NETs顯著增加細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平，與鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin相當(dāng)，而Fer-1預(yù)處理有效地緩解了這一效應(yīng)（圖3A）。同樣，F(xiàn)er-1預(yù)處理顯著減少了ROS的積累（圖3B）。NETs處理顯著增加了PTGS2和ACSL4的表達(dá)，同時(shí)降低了COL I、COL III、GPX4和SLC7A11（圖3C-I）。Fer-1有效地逆轉(zhuǎn)了這些作用。使用C11 LPO探針的流式細(xì)胞術(shù)（圖3J）以及LPO和谷胱甘肽GSH水平的測(cè)定（圖3K和L）進(jìn)一步證實(shí)，NETs在HSF中誘導(dǎo)LPO。正如預(yù)期的那樣，F(xiàn)er-1有效地減輕了NETs對(duì)HSF的影響。Fer-1預(yù)處理減輕了NETs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，這可以通過提高細(xì)胞活力得到證明（圖3M）。這些結(jié)果表明，NETs通過增加LPO和降低抗氧化能力促進(jìn)成纖維細(xì)胞鐵死亡，可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡和功能障礙。

圖3.抑制鐵死亡可減輕NETs誘導(dǎo)的HSF功能障礙并恢復(fù)細(xì)胞活力

4. NETs在HSF內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的調(diào)節(jié)作用

   內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO積累的重要調(diào)控途徑。因此，我們假設(shè)NETs通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來調(diào)節(jié)HSF的鐵死亡。透射電鏡分析顯示，與對(duì)照組相比，NETs處理組線粒體出現(xiàn)鐵死亡（圖4A，黑色箭頭），同時(shí)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顯著擴(kuò)張（圖4A，白色箭頭），表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活。我們進(jìn)一步分析了三個(gè)主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器：ATF6， IRE1α和PERK的激活。WB分析顯示，與對(duì)照組相比，NETs處理顯著增加了IRE1α和PERK的磷酸化，而ATF6的表達(dá)沒有變化（圖4B-E）。這些發(fā)現(xiàn)表明，NETs主要通過IRE1α和PERK途徑而不是ATF6途徑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

圖4.NETs在體外激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

5.IRE1α/XBP1通路是NETs觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)HSF鐵死亡的關(guān)鍵機(jī)制

   為進(jìn)一步研究IRE1α和PERK通路在鐵死亡中的調(diào)控作用，我們用IRE1α抑制劑（KIRA6, 10 μM）、PERK抑制劑（GSK2606414, 2 μM）和鐵死亡抑制劑（Fer-1, 15 μM）預(yù)處理HSF，然后用NETs處理24 h。采用ER-Tracker評(píng)估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張情況。熒光圖像顯示，經(jīng)NETs處理的HSF中，ER熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而經(jīng)KIRA6或GSK2606414預(yù)處理后，ER熒光強(qiáng)度減弱。相反，F(xiàn)er-1預(yù)處理沒有顯著改變NETs處理的HSF中的ER熒光強(qiáng)度（圖5A）。NETs + KIRA6組ROS水平明顯降低，細(xì)胞存活率升高。GSK2606414對(duì)ROS積累的抑制作用不如KIRA6顯著（圖5B），對(duì)細(xì)胞活力的影響最?。▓D5C）。這些結(jié)果表明，抑制鐵死亡不影響NETs誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。PERK通路對(duì)NETs誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的調(diào)節(jié)作用很小。WB分析顯示，KIRA6預(yù)處理的HSF中，PTGS2表達(dá)降低；而SLC7A11表達(dá)增加。GSK2606414預(yù)處理的NETs組中PTGS2和SLC7A11的表達(dá)水平無明顯變化。Fer -1預(yù)處理的NETs組中IRE1α和PERK表達(dá)水平保持不變（圖5D-H）。這些結(jié)果表明，NETs主要通過IRE1α通路的激活來調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而影響HSF的鐵死亡。雖然NETs激活了PERK通路，但它們對(duì)HSF的鐵死亡沒有顯著的調(diào)節(jié)作用。Fer-1對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白的表達(dá)無顯著影響，表明NETs誘導(dǎo)的HSF鐵死亡主要受IRE1α通路的調(diào)控。

   為研究NETs是否通過激活I(lǐng)RE1α/XBP1通路促進(jìn)HSF的鐵死亡，我們使用FerroOrang染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+的積累。FerroOrange的熒光圖像顯示，KIRA6可以抑制HSF中NETs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Fe2+的積累（圖5I）。WB分析顯示，NETs刺激顯著上調(diào)了HSF中XBP1和CHOP的表達(dá)，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1α/XBP1軸被激活。KIRA6預(yù)處理可抑制ACSL4的表達(dá)，同時(shí)恢復(fù)GPX4的表達(dá)（圖5J-N）。透射電鏡顯示NETs處理后細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。與NETs處理組相比，KIRA6預(yù)處理減輕了HSF的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，并顯著恢復(fù)了線粒體形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)（圖5O）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，KIRA6抑制了NETs誘導(dǎo)的HSF脂質(zhì)過氧化（圖5P）。我們的研究結(jié)果表明，NETs通過激活I(lǐng)RE1α/XBP1通路觸發(fā)HSF中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的鐵死亡。

圖5.IRE1α/XBP1通路是NETs觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)HSF鐵死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

6.KIRA6通過抑制NETs誘導(dǎo)的鐵死亡促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合

   我們創(chuàng)建了糖尿病小鼠傷口愈合模型，并在14天內(nèi)監(jiān)測(cè)傷口愈合情況，以評(píng)估NETs誘導(dǎo)的鐵死亡對(duì)傷口愈合的影響（圖6A）。不同時(shí)間點(diǎn)（0、3、7和14天）的代表性傷口圖像表明，與未經(jīng)治療的糖尿病小鼠相比，DM + KIRA6組小鼠的傷口閉合改善（圖6B和C）。此外，KIRA6處理顯著增強(qiáng)了皮膚創(chuàng)面ⅰ型膠原的表達(dá)，恢復(fù)了皮膚的膠原分泌能力。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物（IRE1α， XBP1和CHOP）的表達(dá)下降，伴隨脂質(zhì)過氧化相關(guān)蛋白PTGS2和ACSL4的下調(diào)和抗氧化蛋白GPX4的上調(diào)（圖6D）。這些結(jié)果表明，KIRA6通過抑制NETs誘導(dǎo)的鐵死亡來減輕糖尿病慢性創(chuàng)面。

圖6.KIRA6通過抑制鐵死亡促進(jìn)體內(nèi)糖尿病創(chuàng)面愈合

圖7.示意圖總結(jié)。NETs通過IRE1α/XBP1通路加劇脂質(zhì)過氧化和ROS釋放，從而誘導(dǎo)HSF發(fā)生鐵死亡。

結(jié)論

   綜上所述，我們通過體內(nèi)和體外模型證明了NETs在糖尿病傷口延遲愈合中的作用。具體而言，NETs通過激活I(lǐng)RE1α/XBP1信號(hào)通路啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致HSF發(fā)生鐵死亡，損害成纖維細(xì)胞的修復(fù)功能（圖7）。此外，KIRA6治療有效地減輕了NETs誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并顯著促進(jìn)傷口愈合。調(diào)節(jié)NETs觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子機(jī)制是緩解糖尿病傷口延遲愈合的一種有前景的治療策略。

參考文獻(xiàn)

Zhao H, Liu Y. Neutrophil extracellular traps induce fibroblast ferroptosis via IRE1α/XBP1-mediated ER stress to impair diabetic wound healing. Free Radic Biol Med. 2025 Aug 16;236:17-27. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2025.05.391. Epub 2025 May 14. PMID: 40379156.