再來(lái)一波外泌體高分轟炸

   糖尿病創(chuàng)面修復(fù)仍具挑戰(zhàn)性，主要源于高糖環(huán)境引發(fā)的免疫抑制效應(yīng)——這種抑制常導(dǎo)致過(guò)度炎癥反應(yīng)、血管生成受損及感染易感性增加。然而，如何利用先進(jìn)生物材料減輕免疫抑制并調(diào)控高糖微環(huán)境下巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化的策略尚未完全闡明。本研究報(bào)道了二維碳化物（MXene）-M2巨噬細(xì)胞外泌體（Exo）納米雜化材料（FM-Exo），通過(guò)克服高糖誘導(dǎo)的免疫抑制來(lái)促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面修復(fù)。FM-Exo可實(shí)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞外泌體（M2-Exo）長(zhǎng)達(dá)7天的緩釋?zhuān)⒄宫F(xiàn)廣譜抗菌活性。在高糖微環(huán)境中，相較于單一外泌體，F(xiàn)M-Exo能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路顯著優(yōu)化巨噬細(xì)胞M2a/M2c極化比例，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖遷移，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力。在糖尿病全層皮膚缺損模型中，F(xiàn)M-Exo有效調(diào)控巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，促進(jìn)其向M2表型轉(zhuǎn)化，從而抑制炎癥反應(yīng)、通過(guò)VEGF分泌促進(jìn)血管新生，并改善膠原有序沉積。最終加速愈合進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)瘢痕減少的優(yōu)質(zhì)修復(fù)效果。本研究為應(yīng)對(duì)糖尿病創(chuàng)面提供了新思路，即通過(guò)開(kāi)發(fā)生物活性納米材料來(lái)調(diào)控高糖環(huán)境下的免疫抑制。本文于2024年1月發(fā)表在《ACS Nano》IF：15.8 期刊上。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、表征F127-MXene水凝膠的物理化學(xué)特性

   SEM圖形顯示F127-MXene水凝膠呈現(xiàn)疏松多孔的結(jié)構(gòu)（圖1A），孔徑大小約為20-90μm。EDS 能譜圖（圖 1C）顯示，鈦的特征峰被氧的特征峰所覆蓋。由于水凝膠中 MXene 含量低以及 MXene 中氟元素含量低，在圖 1C 中未觀察到氟的特征峰。此外，對(duì) FM 進(jìn)行的元素分布圖（圖 1B）顯示，C、O、Ti 元素以及少量的 F 元素在樣品中分布均勻，表明 MXene 在 F127 水凝膠中分布均勻。F127 的傅里葉變換紅外光譜（圖 1D）在 2872.6 cm?1 處顯示出 C?H 伸縮振動(dòng)帶，在 1093.8 cm?1 處顯示出 C?O?C 伸縮振動(dòng)，并且FM波譜在摻雜MXene之后沒(méi)有改變，表明MXene引入F127不會(huì)破壞它的結(jié)構(gòu)。圖 1E 展示了隨著溫度升高，G' 和 G" 的變化情況（0 - 40°C）。在溫度低于 20.26°C 時(shí)，G" 大于 G'，這表明 F127-MXene 處于溶膠狀態(tài)。隨著溫度繼續(xù)上升，G' 的增加幅度大于 G''，這表明 FM 水凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，并保持了出色的機(jī)械性能。不同溫度下樣品的狀態(tài)（圖 1F）與圖 1E 中 G' 和 G" 的變化趨勢(shì)一致。圖 1G 顯示了 FM 水凝膠的剪切稀化特性，這是其可注射性的根本原因。隨著剪切速率的增加，水凝膠的粘度從 267.42 倍秒迅速下降至 5.30 倍秒。此外，F(xiàn)M 水凝膠能夠從注射器中順利擠出，形成“花朵”形狀（圖 1H），這直觀地表明了其出色的可注射性。當(dāng)?shù)蛣?dòng)態(tài)應(yīng)變（1%）變?yōu)楦邉?dòng)態(tài)應(yīng)變（1000%）時(shí)，F(xiàn)M水凝膠的G′和G″顯著降低（圖1I）。在第一步應(yīng)變循環(huán)之后，G'顯著降低，這是因?yàn)榈谝淮螇嚎s過(guò)程破壞了水凝膠中不穩(wěn)定的非共價(jià)鍵，這進(jìn)而可能導(dǎo)致水凝膠的結(jié)構(gòu)分解或重組，從而影響其穩(wěn)定性和性能。經(jīng)過(guò)更多的步進(jìn)拉伸循環(huán)后，G' 的變化幅度減小，并顯示出結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，這表明其具有良好的自修復(fù)性能。

圖1 F127-MXene水凝膠的物理化學(xué)特性

2、FM-Exo水凝膠刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的M2極化

   在高糖培養(yǎng)基中共孵育FM-Exo和巨噬細(xì)胞，然后檢測(cè)巨噬細(xì)胞的極化表型。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，F(xiàn)M-Exo組巨噬細(xì)胞表型出明顯的形態(tài)改變（圖2A），形態(tài)邊長(zhǎng)，偽足延伸，并且高表達(dá)CD206（圖2B-C），此外還高表達(dá)M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物ARG1，YM1，IL-10（圖2D）。

圖2 FM-Exo水凝膠刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞的M2極化

   接下來(lái)探究FM-Exo水凝膠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化的分子機(jī)制，檢測(cè)了PI3K-AKT通路的激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，F(xiàn)M-Exo組該通路磷酸化表達(dá)顯著增強(qiáng)，VEGF表達(dá)增強(qiáng)，TNF-a表達(dá)減弱（圖3），表明FM-Exo通過(guò)PI3K-AKT通路激活促進(jìn)M2極化。

FM-Exo水凝膠增加高唐環(huán)境下PI3K/AKT的磷酸化激活

3、FM-Exo促進(jìn)HUVECs的細(xì)胞遷移，管形成和傷口愈合

   接下來(lái)探究FM-Exo水凝膠的條件培養(yǎng)基（CM）對(duì)高糖環(huán)境下HUVECs的保護(hù)作用。如圖4所示，與對(duì)照組比較，F(xiàn)M-Exo顯著促進(jìn)高糖環(huán)境下HUVECs遷移、管形成、傷口愈合。

圖4 FM-Exo對(duì)HUVECs的細(xì)胞遷移，管形成和傷口愈合的影響。

4、FM-Exo改善糖尿病傷口的傷口愈合

   基于體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，接下來(lái)在體內(nèi)探究FM-Exo水凝膠對(duì)糖尿病全層創(chuàng)面的影響。如圖5A所示，建立全層糖尿病皮膚創(chuàng)面模型，并使用分組處理傷口。如圖5和圖6所示，與對(duì)照組比較，F(xiàn)M-Exo水凝膠處理組的傷口愈合速度最快，在第21天時(shí)，幾乎已經(jīng)完全愈合，且顯著促進(jìn)膠原蛋白的沉積和傷口恢復(fù)。

圖5 FM-Exo改善糖尿病傷口的傷口愈合

圖6 FM-Exo促進(jìn)傷口愈合和顆粒形成

   接下來(lái)對(duì)傷口組織進(jìn)行免疫熒光評(píng)估巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，F(xiàn)M-Exo處理組的TNF-a的表達(dá)顯著下降，F(xiàn)4/80標(biāo)記的ARG1陽(yáng)性M2巨噬細(xì)胞的比例顯著增多，iNOS陽(yáng)性的M1巨噬細(xì)胞則顯著減少（圖7）。這些結(jié)果支持FM-Exo通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化改善傷口愈合。

圖7 FM-Exo減輕炎癥通過(guò)誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞形成

   接下來(lái)評(píng)估FM-Exo對(duì)背部創(chuàng)傷的血流量和新生血管網(wǎng)絡(luò)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各時(shí)期的FM-Exo組的傷口處血流量和新生血管數(shù)量均顯著高于對(duì)照組（圖8A和8C）。隨后用α-SMA免疫熒光表征新生血管網(wǎng)絡(luò)，使用VEGF表征新生血管形成，使用COL蛋白的免疫組化表征膠原蛋白合成。結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，F(xiàn)M-Exo組α-SMA和VEGF的表達(dá)均顯著增加，膠原蛋白collagen I/III的表達(dá)也顯著增多（圖8和圖9）。表明FM-Exo可促進(jìn)傷口處的新生血管形成和膠原沉積。

圖8 FM-Exo水凝膠促進(jìn)糖尿病傷口的功能性血管形成

圖9 FM-Exo水凝膠促進(jìn)糖尿病傷口的膠原蛋白沉積

參考文獻(xiàn)：

Jiang X, Ma J, Xue K, Chen J, Zhang Y, Zhang G, Wang K, Yao Z, Hu Q, Lin C, Lei B, Mao C. Highly Bioactive MXene-M2-Exosome Nanocomposites Promote Angiogenic Diabetic Wound Repair through Reconstructing High Glucose-Derived Immune Inhibition. ACS Nano. 2024 Feb 6;18(5):4269-4286. doi: 10.1021/acsnano.3c09721. Epub 2024 Jan 25. PMID: 38270104.